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「青蓮聚焦」我們一起細數微量細胞組學的寶藏

2021-05-28 00:00:00

隨著測序技術的發展,生命科學研究早已進入了單細胞時代,可以從單個細胞的維度上探究細胞、組織、器官的發育過程和疾病相關的細胞異質性和同質性問題。生物學問題通常是呈現多維度、復雜的時空網絡狀的。


樣品量受限的樣品:

在生命科學研究中,樣本的稀缺微量同樣是科研路上的一大挑戰,這時候便需要更適合微量樣本的方法來幫助廣大科研學者突破樣本量問題這大關。如具有高活力和轉移潛能的CTC細胞(循環腫瘤細胞),外泌體,細針穿刺和活檢組織切片樣品等。


異質性:

細胞的天然特性之一,看似相同的一群細胞,其內部有可能存在本質的差別。這種異質性是由很多因素造成的,除了各細胞所處微環境的差異以外,更多的是細胞內在活動的一種表現。研究者越來越不滿足于對單細胞基因組、轉錄組的測序分析,更希望能夠對單細胞蛋白質組進行定性定量分析。通過對生命的重要活動研究,探究單個細胞的蛋白質組是如何變化的。



青蓮站在巨人的肩膀上,總結牛人經驗,克服了微量細胞蛋白組學研究三大難點,下面我們來看看牛人已經發表的方法吧!


01單細胞的獲取

想要檢測單細胞,首先要突破如何分離單細胞。


FACS熒光激活細胞分選配合nanoPOTS芯片進行分離。[2]



在顯微鏡的輔助下,使用毛細管直接從細胞懸浮液中吸取單個細胞至nanoPOTS中進行后續操作。[1]



02樣本前處理技術優化

樣品量極少,酶解效率低。常規蛋白組樣品前處理方法僅適用于大量細胞樣品的處理;微量樣本體系小,酶解效率需要優化提高。適當放大反應體系,提高酶切效率,研發新的實驗流程,降低實驗過程損失。

微流控技術:單個細胞鑒定211個蛋白,使用Match between Runs (MBR)鑒定到669個蛋白。[3]


TMT標記單細胞定量蛋白組學:整個實驗在離心管中完成,Carrier的存在可以降低單細胞樣本的損失,且肽段序列鑒定提供足夠的離子,單個細胞鑒定757個蛋白。[6]



03質譜色譜參數優化

單細胞蛋白組學分析中,無法直接使用常規色譜質譜參數,要提高色譜的分辨率和質譜采集方法。降低色譜柱內徑,降低流速,明顯改善鑒定結果。


當色譜柱內徑從75下降到30um,流速從350下降至60nl/min,可見譜圖強度有明顯提高[5]



當流速從50降低至20nl/min ,肽段鑒定數量增加~50%,蛋白鑒定數量增加~30%,低流速更有助于微量樣本分析。[1]



樣本類型:原代培養的細胞、組織解離后細胞、體液中分離出的細胞


送樣標準:


參考文獻

[1] Anal. Chem. 2020, 92, 2665?2671

[2] Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57: 12370-12374

[3] Zhu et al. Nature Communications, 2018,9, 882

[4] Analytical and Bioanalytical Chemistry volume, 2019, 411: 4587–4596

[5] Zhu et al. Int. J. Mass Spectrom.,2018,427, 4–10.

[6] Budnik et al. Genome Biology (2018) 19:161 ASMS2019 poster ThP722


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