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「青蓮聚焦」自動微創機器人推動空間蛋白組學臨床應用

2023-02-21 12:56:02

202212月,Matthias Mann團隊和慕尼黑亥姆霍茲中心組織工程與再生醫學研究所 (iTERM) Ali Ertürk團隊合作在CELL發表題為Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens 的文章。研究團隊將組織/生物體透明化和成像技術、基于深度學習的圖像分析、機器人組織提取和超高靈敏度質譜的技術進行結合,開發了一種新的溶劑清除器官的3D成像技術結合質譜分析(DISCO-MS,three-dimensional (3D) imaging of solvent-cleared organs ),實現對全組織區域進行無偏的空間蛋白組學分析,以發現各種疾病模型中初始病理事件相關的空間-分子圖譜。


研究背景




在早期階段,許多疾病在大多數未知的組織區域有輕微的病理變化,使其難以識別和表征。例如,癡呆癥的早期變化可能包括少數局部炎性細胞的激活、微血管的變化,以及在未表現出特征的大腦區域中僅出現少數初的β淀粉樣斑塊,限制了我們研究疾病早期診斷和治療的能力。組織清除技術的新進展允許對完整的生物組織(包括小鼠器官和全身以及完整的人體器官)進行熒光成像。組織透明后,激光掃描顯微鏡顯示其細胞和亞細胞細節。利用人工智能AI)引導的圖像分析,即使是細胞結構中的微小變化(否則可能會被忽略),也可以很容易和快速地識別出來。然而,僅憑視覺準確定位這些區域并不能回答分子層面的機制問題。



結果速遞



1:組織透明化技術及其類樣本的蛋白組學穩定性分析

組織透明化技術(tissue clearing technologies)是指通過化學試劑處理讓動物的全身或整個器官變得透明,然后利用三維組織染色和成像方法,讓特定類型的細胞或組織在透明動物體內呈現出來。文章選用多種透明化方法基于MS蛋白質組分析對透明化處理后的小鼠和人類標本進行高深度分析(1)。結果顯示所有透明化方法條件下小鼠腦組織中鑒定了6000多個蛋白質,在定性和定量上與新鮮組織相似,并且在生物復制中具有高度的可重復性;在人腦組織中,所有透明化方法條件下包括SHANEL(小膠束介導的人體器官清晰化和標記,是一種由去污劑滲透化學法驅動的新方法)在內鑒定出5000多種蛋白,與多聚甲醛(PFA)固定對照非常相似,且具有高定量再現性(R=0.91–0.96)(圖2)。


1:組織透明化過程及蛋白組學質譜分析流程


圖2:不同組織透明化技術蛋白組學結果分析


2:對顯微解剖組織的蛋白質組進行三維成像

作者對3D成像和定位的小的靶向組織區域(~0.0005 mm3)進行無偏倚的蛋白質組分析。在此過程中,文章先調整透明化步驟,使已經被透明化的剛性組織變軟能夠進行顯微切割,通過AI實現了2D激光捕獲顯微切割和3D光片成像的對應匹配(圖3A),通過改良質譜檢測平臺,實現更靈敏度水平(納克級別)的組織蛋白質組學研究。


以創傷性腦損傷 (mTBI) 小鼠模型為例,對含有局部分散炎癥的區域進行了分析,證實了技術的應用潛能。研究人員沿著視束區域活化的小膠質細胞,使用LCM獲取3個相鄰的感興趣區域(ROIs)進行蛋白質組學分析 (3B3C) 。質譜分析在每個ROI樣本中定量到多達1400個蛋白,mTBI和假手術對照組的所有ROI中包含602種共同蛋白,并揭示了mTBI組的ROI區域的共有蛋白質組特征及各ROI區域的獨特蛋白質組特征 (3D) 。主成分分析 (PCA) 對比mTBI和假手術對照組之間的蛋白質組差異 (3E) ,一些與軸突損傷和修復相關的蛋白質在不同條件下受到強烈的差異性調節。


圖3:DISCO-MS蛋白組學結果揭示了mTBI在全腦離散區域的影響


3:SHANEL清除人心臟冠狀動脈的空間蛋白質組學

急性心肌梗死(MI)是導致心血管死亡的主要因素。作者選用在冠狀動脈疾?。?/span>CAD)中測試DISCO機器人輔助DISCO-MS方法,為研究其的空間結構。


使用PFA固定的人心臟,用葡聚糖標記其血管,并使用SHANEL人體器官清除方案清除整個心臟(圖4A4B),并提取大斑塊相關區域周圍的六個ROI和小斑塊相關區域至無斑塊相關區域的六個ROI,這可以代表同一心臟冠狀動脈沿線的早期斑塊形成,用于DISCO-MS分析(圖4C–4F)。結果顯示每個ROI中能檢測到1300個蛋白質,發現53個下調的蛋白質和6個上調的蛋白質(圖4G)。GO術語和途徑分析表明,肥厚型心肌病、心肌收縮(TPM1、TPM2、MYL2、MYL3、MYH6、MYBPC3、DES)、局灶性粘附、凝血、纖溶酶原激活、血小板聚集、纖維蛋白原復合物、凝血級聯(SERPING1、FGA、FGG、FGB、FN1)具有顯著調節(圖4H),一些以區域特異性的方式進行調節的蛋白包括MYH10、MYH11、FGA、FGBFGG,已經被報道與斑塊相關(圖4I)。此外,還發現了肌球蛋白重鏈(MYH8)的上調(2.2倍,p<0.05),這是動脈粥樣硬化斑塊中的一種罕見的標志蛋白。


圖4:來自冠狀動脈動脈粥樣硬化斑塊的人類心臟清除、成像和蛋白質組學




結論



本文介紹了全新的空間無偏蛋白質組學技術(DISCO-MS) ,該技術包括完整器官和生物體的3D成像數據,能夠無偏識別和自動提取感興趣的組織區域,并包括后續的分子表征。研究團隊探索性的將該方法應用于早期AD疾病模型小鼠的全腦組織及動脈粥樣硬化斑塊的人類心臟組織,繪制了相應組織的三維立體空間分子圖譜,揭示了組織與疾病的異質性,這對于疾病的認知與局部靶向治療至關重要。


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