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「青蓮聚焦」精準醫療|食管鱗狀細胞癌多組學圖譜揭示癌癥分型

2023-02-21 13:04:47
食管癌在全球發病率排名第七,死亡率排名第六,5年生存率為20%。大約50%的病例發生在東亞和中亞,特別是在我國,食管鱗狀細胞癌(ESCC)是主要的組織學類型?;熀头暖熑匀皇菢藴实闹委煼椒?,然而,目前還沒有有效的生物標志物或分子分類方案來為ESCC患者量身定制治療方案。

20221229日,中國醫學科學院腫瘤醫院劉芝華/焦宇辰團隊、深圳灣實驗室詹啟敏/崔永萍團隊合作,在Cancer Cell(影響因子:38.585)上發表了文章Integrated Multi-omics Profiling Yields a Clinically-Relevant Molecular Classification for Esophageal Squamous Cell Carcinoma,通過多組學(全基因組、表觀基因組、轉錄組蛋白質組)特征描述了食管鱗狀細胞癌圖譜,并整合數據將食管鱗癌分為四種分子亞型:細胞周期通路激活型(CCA)、NRF2通路激活型(NRFA)、免疫抑制型(IS)和免疫調節型(IM),每個亞型都具有潛在的治療靶點/可用于診斷的生物標志物,為患者實現精準醫療提供了基礎數據和思路。


研究亮點



1、隊列數據建立關于ESCC多組學、多層次分子表達圖譜概況;


2、多組學數據結合聚類分析將ESCC分為四種分子亞型;


3、分析每種ESCC亞型特征以及潛在靶點;


4、機器學習挑選特定分子特征的分類體系通過識別IM亞型來預測ICB療法的響應性;



研究思路



結果展示

一、基于多組學數據的ESCC分型

為了深入地探索ESCC的分子特征,作者對155ESCC患者的癌和癌旁組織進行了全基因組測序(WGS)、全基因組甲基化測序(WGBS)、RNA測序(RNA-seq)和小RNA測序(sRNA-seq)以及蛋白質組學73例)。利用這些數據,對155例病例進行了一致性聚類和聚類分配的再聚類(COCA)分析,產生了四個亞型(圖1A),它們與臨床TNM分期、淋巴轉移和免疫評分顯著相關(圖1B1C)。四種亞型分別為:(1)以CCND1CDKN2A/BCNAs為特征的細胞周期信號激活(CCA)亞型(25.2%,n = 39)(圖1A、1D);(2NFE2L2SOX2基因上調的NRF2致癌激活(NRFA)亞型(24.5%,n=38)(圖1A、1E);(3)免疫抑制(IS)(19.3%,n=30)亞型,具有更高水平的浸潤B細胞和NK CD56bright細胞,以及更高的ERBB2蛋白水平;(4)免疫調節(IM)亞型(31.0%,n=48),其成纖維細胞、CD8+T細胞、先天免疫細胞浸潤較高以及免疫評分較高(圖1C)。

 1四種COCA亞型的特征(A-COCA亞型分組的關鍵分子和臨床特征;B-TNM分期和淋巴轉移的比例;C-基于COCA亞型的免疫評分;D-CCA和非CCA亞型中CNAs特征比例餅圖。(ENRFA和非NRFA亞型中,NRF2通路基因變化情況餅圖。

二、CCA亞型與激活的細胞周期信號有關

CCA亞型的特征為復發性CNA,分子特征體現在11q13.3/CCND1擴增(74.4% vs 23.3%,CCA亞型 vs CCA亞型)和CDKN2A/B同源缺失(59.0% vs 37.9%,CCA亞型 vs CCA亞型)(圖1D、2A)。11q13.3中受影響的基因組區域含有致癌基因CCND1、CTTN等,這些基因在CCA病例腫瘤組織中的表達水平顯著增高(圖2B)。CCA樣品中CDKN2A/B的表達水平顯著降低(圖2B),CDKN2A/B也通過突變和啟動子區的高甲基化途徑失活??傊?,84.6%CCA病例具有與細胞周期失調直接相關的基因變化(圖1D)。

為檢測CCA亞型患者能否從CDK4/6抑制劑(palbociclib)治療中獲益,研究者構建了3類食管鱗癌類器官模型(PDOs):CDKN2A缺失(PDO4)、CDKN2A缺失/CCND1擴增(PDO7)、CDKN2A/ CCND1兩個基因野生型類器官(PDO2)。觀察細胞生長研究者利用PDO半數抑制濃度(IC50)值來評估palbociclib藥物敏感性,發現palbociclibPDO2中的IC5041.33μM)顯著高于PDO4PDO7IC50分別是13.58μM2.03μM),表明有細胞周期改變的食管鱗癌患者對palbociclib更加敏感(圖2F)。因此,推測部分CCA亞型患者可從CDK4/6抑制劑的治療中獲益。

圖2 CCA亞型與細胞周期信號傳導的激活相關(A-CCA和非CCA病例之間細胞周期通路中的基因組變化;B-COCA亞型腫瘤和非腫瘤組織中11q13.3基因表達水平的比較;C-CCA和非CCA亞型細胞周期中基因的突變頻率;單抗治療下患者衍生類器官(PDO)的明視野圖像(D)和細胞活力(E);F-PDO中palbociclib單抗的IC50值。


三、NRFA亞型中NRF2和SOX2信號被激活

NRFA亞型的特點是NRF2通路中的基因突變(NFE2L2擴增、NFE2L2突變、KEAP1/CUL3突變)(圖1E3A)。分析ESCC亞型中NRF2通路的基因的表達情況,發現在NRFA樣本中,NFE2L2的表達水平顯著高于其他三種亞型(圖3B)。此外,NRFA亞型中KEAP1的蛋白質水平降低(圖1A)和SOX2基因高表達(圖3A3B)。多組學分析NFE2L2和轉錄因子SOX2mRNA表達水平呈正相關(圖3C),確定了NRFA亞型中的全新機制,即NRF2通路因SOX2的轉錄上調而被激活。

ESCC腫瘤細胞ZEC145ZEC166進行了ChIP分析。結果顯示SOX2NFE2L2的啟動子區的特定區域結合(圖3D)。此外,敲低SOX2顯著降低了NRF2NQO1mRNA和蛋白質水平(圖3F3G)。這些數據證明了ESCCSOX2介導的NRF2調節,并突出了SOX2表達可作為NRFA亞型的候選標志物。對ESCC組織進行NRF2免疫組化染色(IHC)分析,結果顯示NRFA病例中NRF2的蛋白質水平顯著升高(圖3H),且NRFA亞型中NRF2通路基因的變異和SOX2擴增的患者NRF2蛋白表達水平高(圖3I/J,更多的患者可能從靶向NRF2的治療中獲益。

圖3NRFA腫瘤亞型中的多組學變化(A-NRFA和非NRFA腫瘤中NRF2通路基因和SOX2的基因組學變化;B-四種COCA亞型中NFE2L2、KEAP1、CUL3和SOX2的基因組變化和基因表達水平差異;C-NFE2L2和SOX2表達水平之間的關聯性;D-通過染色質免疫沉淀法(ChIP);E-SOX2在NFE2L2啟動子區中的結合;ESCC細胞ZEC145(F)和ZEC166(G)中SOX2、NFE2L2和NQO1的mRNA和蛋白質表達水平;H-四種COCA亞型標本中NRF2的免疫組化(IHC)染色(n=74);I和J-NRFA亞型中NRF2的IHC染色。


四、CCA和NRFA亞型富含CpG甲基化島表型

通過WGBS數據分析發現腫瘤樣本中的CpG島(CGI)區域整體上甲基化程度較低(圖4A)。差異甲基化區域(DMR)的分析發現高DMR甲基化富集在啟動子區(尤其是啟動子CGI區),而大多數低甲基化DMR分布在基因間、增強子和基因體區(圖4B)。因此,專注于高甲基化啟動子CGI位點,并通過208個位點定義了食管CpG甲基化島的表型(E-CIMP),這些位點在超過50%ESCC樣本中顯示出高甲基化(圖4C)。在所有病例中,E-CIMP+CCANRFA亞型中富集程度高(圖4E)。

 圖4 CCA和NRFA亞型中DNA甲基化改變及其相關性(A-全基因組甲基化水平和DMR區域;B-低甲基化DMR(左圖)和高甲基化DMR(右圖)分布情況;C-基于208個CIMP甲基化位點的甲基化水平;D-通過ESCC標志物定義的CIMP組和TNM分期或淋巴轉移的比例;E E-CIMP+和E-CIMP-亞型中CCA+NRFA和IS+IM病例的分布。


五、IS和IM亞型具有不同的免疫細胞浸潤情況

為了系統地描述四種ESCC亞型之間腫瘤微環境(TME)的差異,分析了主要腫瘤浸潤免疫細胞和基質細胞群的分布情況,發現ISIM亞型均顯示出高水平的浸潤免疫細胞,這與ISIM亞型的高免疫評分相一致(圖5A)。免疫細胞的浸潤通過組織微陣列(TMA)中的多標記免疫熒光(MIF)進行驗證。結果證明,IS亞型富含B細胞和NK CD56bright細胞,而IM亞型富含CD8+T細胞和巨噬細胞(圖5B5C)???/span>PD-1治療在ESCC患者中產生了異質性反應,因此應用一種算法(圖5D)探討了ISIM病例的免疫學相關特征。發現IM中的主要免疫細胞組成(名為“CD8+T巨噬細胞);而IS中的主要模塊(名為“CD4+Tcm-Tem”)(圖5D)。

圖5 ESCC中的腫瘤浸潤性免疫細胞(A-熱圖顯示了四個COCA亞群中腫瘤浸潤免疫細胞的標準化富集分數(NES);B-四種COCA亞型樣品的多標記免疫熒光(MIF);C-基于MIF分析的四種COCA亞型樣本中免疫細胞的比率;D-IS(上)和IM(下)病例的TME圖。


六 IM分類預測免疫治療反應
為了探討基于多組學的分子分類與免疫檢查點阻斷(ICB)反應之間的關系,通過一項抗PD-1抗體(SHR-1210)單藥治療的I期臨床試驗(NCT02742935),收集43ESCC患者的樣本及臨床信息,患者的治療反應被評估為部分反應(PR)、進展性疾?。?/span>PD)或穩定疾?。?/span>SD)。對治療前收集的腫瘤組織樣本進行多組學分析(mRNA表達數據、外顯子組測序數據和DNA甲基化數據)。結果表明,PR患者聚集在IM亞型,而PD患者聚集在CCA/NRFA/IS亞型(圖6A)。由于IM患者對PD-1抗體更敏感,基于155ESCC病人的多組學數據,開發了一種分類方案,以識別ESCC IM亞型的病例特征。終模型包含28個多組學特征,并在驗證數據集(n=61)中獲得了良好性能(圖6C6D)。此外,在17名接受PD-1治療的患者獲得了所有28個組學特征的高質量數據并應用了該IM分類方案(圖6B),識別出7PR病例中的6例為IM,10PDSD病例中的9例為非IM,特征模型在預測免疫治療的響應性方面,顯示出85.7%的敏感性和90%的特異性,(圖6G)。之后,利用公共數據庫從TCGA ESCC81例患者中識別出17IM患者。這些結果表明,IM分類法方法可篩選抗PD-1治療的獲益者并預測其免疫治療療效,有非常重要的臨床價值。

圖6 IM亞型分類預測免疫治療的反應(A-基于COCA亞型之間差異表達基因的樹狀圖;B-多組學IM分類模型示意圖;C-受試者操作特征(ROC)曲線;D-分類特征表達熱圖;E-分類的特征重要性條形圖;F-抗PD-1臨床試驗中預測為IM組和非IM組患者的Kaplan-Meier生存曲線;G-IM分類對PD-1響應者的ROC曲線。



總結

本研究基于大隊列生物樣本的多層次數據(全基因組、表觀基因組、轉錄組和蛋白質組)全面整合分析,將食管鱗癌ESCC分為CCA、NRFA、ISIM四個分子亞型,在ESCC的每個亞型中,發現了潛在的治療靶點和診斷標志物,這為未來ESCC的精準治療提供了堅實的基礎。


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