蛋白質組學

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修飾蛋白質組學
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糖基化蛋白質組學

糖基化蛋白質組學

  • 所屬分類:修飾蛋白質組學
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  • 發布日期:2022-07-15 15:58:40
  • 產品概述
  • 案例解析

作為一種重要的翻譯后修飾,蛋白質糖基化它參與和調控生物體的許多生命活動。隨著蛋白質組技術的不斷發展,蛋白質糖基化研究越來越受到廣泛的重視。


技術原理

親水相互作用色譜(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)是基于富含多羥基的糖鏈結構的強親水特性,采用極性固定相和非極性流動相的色譜技術,利用了糖肽由于糖鏈的加入而增強的親水性,糖肽會有較長的保留時間,而使糖肽與非糖基化肽段得以分離的糖肽富集技術。HILIC對不同類型的糖肽沒有偏性,且能保持糖鏈結構的完整性,適合作為完整糖肽結構研究中的富集技術。單一的N-糖蛋白的位點鑒定,蛋白Trypsin酶解成肽段后,HILIC方法富集糖肽,N-糖酰胺酶(PNGase)切除連接在天冬酰胺殘基上的糖鏈(重水),再利用蛋白酶去除PNGase F,質譜分析。復雜樣本糖基化蛋白及修飾位點的確定, 是運用的Byonic法, Byonic搜索引擎能夠靈敏而多方面的對肽和蛋白質進行鑒定, 其配套的PreviewTM軟件,可快速評估肽段質量誤差、消化特異性以及Byonic后續多方面搜索的修改。

糖基化蛋白質組學數據分析流程圖


技術優勢

1.相關領域專業技術支持;

2.經驗豐富的實驗操作人員;

3.自主研發改進的具有技術的操作方法;

4.動物植物多種案例經驗累積;

5.人才濟濟的生物信息分析團隊。


應用領域

基礎醫學、臨床診斷:生物標志物,疾病機理機制,疾病分型,個性化治療等;

生物醫藥:藥物作用機理,藥效評價,藥物開發等;

微生物領域:致病機理,耐藥機制,病原體-宿主相互作用研究等; 

海洋水產:漁業資源,海水養殖,漁業環境與水產品安全等;


糖基化修飾蛋白組學案例解析


SARS-CoV-2峰值的位點特異性聚糖分析

Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike


研究對象:SARS-CoV-2病毒S蛋白             期刊:Science

影響因子:41.845                                      發表單位:英國南安普敦大學



研究背景

新型冠狀病毒SARS-CoV-2(COVID-19的致病因子)的出現對全球人類健康構成了重大威脅。疫苗的開發集中在引起體液免疫反應的靶點,即刺突(S)糖蛋白,它介導細胞進入和膜融合。SARS-CoV-2 S基因編碼22個N-連接的糖基序列,可能在蛋白質折疊和免疫逃逸中起作用。該研究采用位點特異性質譜方法, 揭示了重組SARS-CoV-2 S免疫原上的聚糖結構,展示了SARS-CoV-2 S聚糖與典型宿主聚糖加工的不同之處,這可能對病毒病理生物學和疫苗設計有影響。

樣本策略:純化的293F細胞重組的新冠病毒S蛋白

技術策略:基于質譜的糖基化蛋白質組技術


結果速遞

為了解決SARS-CoV-2 S蛋白的位點特異性糖基化并可視化糖鏈異質體在整個蛋白表面的分布,研究人員表達純化了293F細胞重組的新冠病毒S蛋白,SARS-CoV-2 S糖蛋白的示意圖如下(圖1A)。利用尺寸排阻色譜法純化含有重組SARS-CoV-2 S的上清液,確保只分析天然的三聚蛋白(圖1B)。用電鏡負染對純化的三聚體構象進行驗證( 圖1C)。然后分別用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和A裂解蛋白酶將S蛋白酶解成肽段,每個片段包含一種N-糖基片段,使用質譜法確定每個位點的聚糖組成。

圖1. SARS-CoV-2S糖蛋白的表達及驗證


通過質譜方法測定出S蛋白上的22個N-糖基化位點( 圖2),其中18個糖基化位點在SARS病毒S蛋白中是保守的。研究人員發現S蛋白糖基化位點的糖鏈修飾分為寡甘露糖型、雜合型和復合型三種糖鏈類型,其中復合型糖鏈占比較高,不同糖基化位點的多糖種類和豐度差別較大。餅圖總結了這些多糖的定量。根據寡甘露糖型聚糖含量將其著色,標記為綠色(80?100%)、橙色(30?79%)和粉紅色(0?29%)的多糖位點。條形圖表示三個生物學重復的平均值,誤差條表示平均值的標準誤差。

圖2. SARS-CoV-2 S糖蛋白的位點特異性N-糖基化


研究人員利用S蛋白的電鏡結構,將糖基化狀態映射到了整個病毒S蛋白三聚體上, 揭示了N-糖基化如何在SARS-CoV-2 S蛋白整個表面上封閉不同的區域。結果表明SARS-CoV-2 S蛋白與其他病毒糖蛋白相比糖基化程度較低, 形成的“ 糖盾” 較少, 這有利于開發中和抗體。此外,復合型聚糖的處理是免疫原工程中的重要考慮因素。

圖3. 基于結構的SARS-CoV-2 S N-連接的聚糖圖譜


該研究對SARS-CoV-2的糖基化分析提供了天然折疊的三聚體刺突蛋白特有的位點特異性聚糖特征。隨著越來越多基于糖蛋白的候選疫苗的開發,其詳細的糖基分析為比較免疫原完整性提供了一條途徑,并且隨著生產規模擴大到臨床用途,對監測也很重要。因此,在血清學檢測試劑盒的生產中,聚糖譜分析也將是抗原質量的重要指標。然后隨著以核苷酸為基礎的疫苗出現,了解這些傳遞機制如何影響免疫原的加工和呈遞至關重要。


參考文獻

Watanabe Y, Allen JD, Wrapp D, et al. Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike[J]. Science, 2020, 369:330-333.


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藥物靶點(Drug Target)是指體內具有藥效功能并能被藥物作用的生物大分子,作為藥物靶點的主要蛋白家族就有GPCR受體,離子通道、核受體、激酶等。自21世紀以來,基于靶點的藥物發現模式逐漸取代了傳統的基于藥物化學結構的發現模式,成為現代創新藥物研發的主流模式。

因此,事先確定靶向特定疾病有關的靶點分子是現代新藥開發的基礎。針對靶點的研究可以清楚疾病癥結所在,從而確定了新藥的研發方向。此外靶點的研究還有助于了解藥物作用機制,進而對已有藥物進行改造,研發出毒性更小、選擇性更強、治療效果更好的新藥。

既然靶點研究如此重要,那么該如何去發現這些靶點呢?今天小編就給大家梳理下如何利用組學手段去篩選藥物靶點以及研究藥物作用機制!



文獻案例1

雙修飾蛋白組揭示肝母細胞瘤的潛在治療靶點-HSPB-1


上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心潘秋輝教授和徐敏教授團隊在知名期刊Signal Transduction and Targeted TherapyIF13.493)上發表題為“Global profiling of O-GlcNAcylated and/or phosphorylated proteins in hepatoblastoma”的研究論文。以肝母細胞瘤(Hepatoblastoma,HB)為研究對象,從蛋白質修飾組學的角度,對HB組織和正常肝組織進行大規模的磷酸化修飾和O-糖基化修飾鑒定,雙修飾組學聯合分析找到了肝母細胞瘤的潛在治療靶點HSPB-1。




研究思路

研究者首先應用4HB組織與正常肝組織進行蛋白質免疫印跡和免疫組化實驗,研究者發現相較于正常肝組織,HB組織蛋白上存在較高的O糖基化修飾水平。又有先前研究表明O糖基化與磷酸化可能共同發生在蛋白相同或不同的絲氨酸或蘇氨酸位點,因此研究者對上述樣本又開展了O糖基化修飾與磷酸化修飾質譜分析。



1WBIHC實驗結果以及修飾組學工作流程


通過組學大數據和生信分析,52%鑒定到的O糖基化蛋白同時被鑒定到了磷酸化修飾,這些蛋白主要與染色質調控,轉錄,翻譯,轉運以及細胞器組成相關。PPI網絡分析發現雙修飾的蛋白可能在部分細胞信號轉導過程中發揮協同作用。研究者進一步根據其已知功能將具有O糖基化修飾的蛋白質進行分類(圖2)。其中參與腫瘤發生過程的雙修飾蛋白NPM1,HSPE1以及HSPB1引起作者注意,并通過IP-WB進一步證實了其蛋白的磷酸化水平與O糖基化水平在腫瘤組織中與正常組織的差異變化。


2O.糖基化蛋白功能分類,每個紅點代表一個O-糖基化修飾的位點
結合早期研究結論,作者鎖定HSPB1可能是HB的潛在治療靶點。研究者通過實驗證明了在HB細胞系中HSPB-1存在O糖基化和磷酸化,且在82位絲氨酸位點,O糖基化與磷酸化存在競爭關系。此外,通過體外藥物實驗發現,HSPB-1O糖基化水平能夠影響HB細胞對順鉑藥物的耐受性,該結果進一步表明,HSPB-1可能是肝母細胞瘤的潛在治療靶點。



參考文獻

Song Hang,Ma Ji,Bian Zhixuan et al. Global profiling of O-GlcNAcylated and/or phosphorylated proteins in hepatoblastoma.[J] .Signal Transduct Target Ther, 2019, 4: 40.




文獻案例2

OVID-19由SARS-CoV-2引起,重癥患者多采取機械通氣和預防繼發感染等支持性措施,確診和死亡率高,到目前為止還沒有批準的藥物可用于 COVID-19 治療。因此,深入了解體液的分子和代謝變化至關重要。



2021年4月15日,李玉明等人在Signal Transduction and Targeted Therapy期刊(IF=13.493)上發表了題為Multi-platform omics analysis reveals molecular signature for COVID-19 pathogenesis, prognosis and drug target discovery的研究論文。該研究通過多組學聯合的方法(蛋白質組學+代謝組學+脂質組學對COVID-19 患者血漿和尿液進行了分析,揭示了潛在的治療靶點,解釋了SARS-CoV-2感染機制,對藥物研發、患者治療和預后等提供了支持。



  • 文章標題:Multi-platform omics analysis reveals molecular signature for COVID-19 pathogenesis, prognosis and drug target discovery

  • 發表期刊:Signal Transduction and Targeted Therapy

  • 影響因子:IF=13.439

  • 蛋白組技術手段:DIA




實驗設計






結果速遞
1. COVID-19患者的血漿蛋白質組、氨基酸和脂質組譜

對三種人群(重癥、非重癥、健康)血漿樣品進行DIA蛋白定量、脂質組和氨基酸檢測,定量到1,254個蛋白質、664個脂質小分子和16種氨基酸,并對篩選到的差異物質進行聚類分析、時間序列分析、表達模式分析、功能注釋等,分析了與SARS-CoV-2感染相關的異常表達物質。后期構建了隨機森林機器學習模型,選擇了 25 個重要變量,包括 4 種蛋白質和 21 種脂質。







2.預測患者 COVID-19 疾病嚴重程度的生物標志物特征

基于蛋白質組、氨基酸和脂質組數據構建了隨機森林機器學習模型,優先選擇了 25 個重要變量,包括 4 種蛋白質和 21 種脂質,可作為潛在的預測疾病嚴重程度的生物標志物。使用10名患者組成的血漿驗證隊列發現這25種物質中量化了19種分子,使用疾病患者尿液樣本發現8 個分子能夠被量化,這說明這25種物質可作為區分非重癥和重癥患者的潛在指標。







3. SARS-CoV-2感染多組學變化的工作模型
總結COVID-19患者血漿中的差異表達因子,尋找病毒感染和炎癥反應中的關鍵蛋白(DEFA1、APOs、SAA1等)以及相應的脂質或氨基酸(Cs、TGs、PS等)。COVID-19 患者血漿中 PCs 豐度的降低揭示了巨噬細胞膽堿胞苷酰轉移酶 α 的異常,該酶利用 PC 產生 CDP-膽堿。PS 表達細胞與免疫細胞之間的相互作用觸發了免疫抑制途徑,因此血漿中 PSs 上調揭示了感染期間存在免疫抑制。






4. SARS-CoV 感染的潛在治療藥物靶點發現
血漿中分子特征的豐度變化反映了 SARS-CoV-2 感染期間病毒-宿主的相互作用,研究人員分析了基于肺組織中富集蛋白質的潛在藥物靶標和 HPA 中標注的食品和藥物管理局 (FDA) 批準藥物的靶標,確定了五種肺增強蛋白,包括 MRC1、組蛋白 H4、CCL18、SG3A1和 CLEC3B。此外,還確定了 FDA 批準藥物的其他8種靶點(S100A8、S100A9、FGB、C5、ITGB3、KLKB1和 ANXA1),并根據網絡分析確定了靶點對應的靶向藥物。



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